WB常见问题分析
时间：2016-01-03 16:01:46作者：admin文章来源：浏览：
WB实验常见问题分析：1 没有信号标本问题标本中不含检测蛋白：设置阳性对照上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量转膜问题转膜
WB实验常见问题分析：
1. 没有信号
标本问题
标本中不含检测蛋白：设置阳性对照
上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量
转膜问题
转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker.
洗涤过度：减少洗涤时间和次数.
封闭
封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂
抗体孵育和检测
抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间
一抗不工作：设置阳性对照
二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作
一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗
底物失活：重新配制有效的底物
2.背景高
封闭
封闭时间不够：延长封闭时间
优化封闭试剂的类型和浓度
封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂.
磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭
抗体孵育和检测
一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度
孵育温度太高：建议4度孵育过夜
其他
洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜
曝光时间过长：缩短曝光时间
出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜
二抗非特异性：设置只加二抗对照
3.非特异性条带
标本制备
二聚体或者多聚体：增加上样前煮沸变性时间
蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在.
蛋白降解：使用新鲜制备的标本，标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂
上样量过大：减少上样量
封闭Blocking
封闭不充分：优化封闭时间和封闭试剂浓度
抗体孵育和检测
一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度
抗体没有经过纯化
二抗非特异性结合：使用二抗对照
其他
洗膜保证充分
4.条带大小不对
标本制备
二聚体/多聚体存在：使用还原变性电泳，除非说明书上有特殊说明
多个亚型存在？（Isoforms）
蛋白降解？
蛋白修饰
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