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慢病毒实验技术实践操作总结

时间:2016-01-03 16:20:04作者:admin文章来源:浏览:
慢病毒简介慢病毒载体(Lentivirus Vector)是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。能高效的将目的基因或RNAi片
慢病毒简介
 
慢病毒载体(Lentivirus Vector)是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。能高效的将目的基因或RNAi片段导入动物或者人的原代培养细胞或细胞系中,即将外源性基因有效的、稳定的整合到宿主染色体上,实现所谓“稳定整合”,从而使目的基因在目标细胞系中持久表达。其区别于一般的逆转录病毒载体的特点是对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在这里,建议针对如神经元细胞、各种干细胞、心肌细胞等,通常印象中使用传统的转染手段如脂质体2000(Lipofectamine2000)、Qiagen Effecience transfection、或者电转等难以实现目标基因或者RNAi片段有效整合的细胞,采用慢病毒载体感染的方法,问题将迎刃而解。

慢病毒技术
 
1、构建原理
 
慢病毒属于逆转录病毒科 , HIV-1 DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。除 gag 、 po l 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外 , 还包括 4 个辅助基因 :vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev ;
 
gag基因编码病毒的核心蛋白,pol基因编码病毒复制所需的酶类,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
 
2、构建原则
 
由于慢病毒技术是基于HIV系统;因此,降低并控制其实验应用风险就是第一原则。主要使用的方法是将HIV原有的重要序列进行拆分和替换,减少其被拆分成分同源重组而产生具有复制增殖能力的病毒颗粒。
 
包装成分:由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建 , 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白 ;
 
载体成分:与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因;
 
水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒,分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒,使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这么做的意义:1、包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能;2、使HIV载体感染宿主的范围扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞;3、VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。
 
3、四质粒系统
 
目前,我们实验室拥有的,能够投入使用的慢病毒包装体系有两套,都是四质粒系统。分别为常用于构建shRNA体系的DR8.47、PDM2G、REV、PLVTH、pSUPER(pSUPER属于过渡性质的,相当于二传手角色,要的是它上面的启动子,并不是包装质粒),以及常用于过表达系统的PLP-1、PLP-2、VSVG、TOPO-dsRED/TOPO-Luciferase GFP。

 

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